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产品名称:SE无缝克隆和组装试剂盒 SE Seamless Cloning and Assembly Kit(ZC231)促销截止时间:2018.12.31

货号 规格 价格 订购数量 是否现货
ZC231-1 20次 420 - + 有货
ZC231-2 60次 1050 - + 有货

■ 产品简介

本产品利用高效重组酶和同源重组原理,只需DNA插入片段末端与载体末端具有15-20个同源碱基序列,就可以在载体的任意位点完成目的片段与载体的克隆重组。本产品可实现1-4个片段的高效无缝拼接;采用非连接酶克隆体系,可极大地降低载体的自连,保证产品克隆阳性率在90%以上。


■ 产品特点

1. 灵活的克隆位点:任何载体的任意位置。

2. 快速简便:30分钟完成载体构建。

3. 精确:不会增加任何额外的程序。

4. 效率高:高达90%阳性克隆率。


■ 无缝克隆流程图



■ 常见问答


1、“同源序列”指的是特殊序列吗?

答:无缝克隆要求的同源序列不是某个特殊序列,简单讲同源序列可以直接理解为“相同序列”,即DNA片段的连接处有15-20个相同的序列。


2、最佳克隆位点选择?

答:在选择克隆位点时,应避免选择上下游50bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时,重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%,重组效率会受到较大影响。


3、同源序列的长度与退火温度计算?

答:同源序列长度推荐15-20bp。实验结果显示,低于15bp(如10bp),转化率明显下降;大于20bp(如30-40bp),转化效率差异不大,考虑成本,不推荐20bp以上。

计算扩增引物退火温度时,只需计算基因特异性扩增序列的Tm值,末端同源序列不应参与计算,为了得到高效率克隆,建议Tm≥48℃。


4、无缝克隆插入片段的最短长度?

答:建议插入片段≥100bp。


5、PCR扩增产物带A尾(或者其他尾)是否影响无缝克隆?

答:任何PCR酶扩增产物都可以用于无缝克隆,无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除,在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变或者产物要求高保真时,建议使用高保真聚合酶进行扩增。


6、 酶切产物做无缝克隆是否要做去磷酸化处理?

答:不需要。


7、PCR产物做无缝克隆是否要切胶纯化?

答:PCR产物同时满足以下条件时,产物纯化即可,不必切胶纯化:

A、PCR模板不为质粒或者质粒抗性不同于目标载体;

B、无明显杂带且主带占95%以上。


8、无缝克隆长斑数较少?

答:主要可能有以下几种情况:

1)引物设计不合适:推荐【同源序列(15-25 bp)+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】,GC含量40% - 60%。

2)感受态细胞效率低:使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞,确保其转化效率>107 cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验,以检测感受态细胞的转化效率。选择克隆感受态细胞(如DH5α),不能选择表达感受态细胞。

3)线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量,或者比例不佳:尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。

4)线性化载体和插入片段扩增产物不纯,抑制反应:线性化载体和插入片段扩增产物未纯化,直接使用时,使用总体积应不超过反应体系体积的1/5,如10μL体系不超过2μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化,纯化产物溶解在ddH2O中。


9、出现较多假阳性?

答:主要有以下几种可能情况:

1)载体线性化不完全:即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全,优化酶切体系,提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。

2)插入片段扩增产物混有非特异扩增产物。建议:①优化PCR体系,提高特异性;②胶回收PCR产物;③鉴定更多克隆。

3)反应体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时,若扩增产物直接用于重组反应,残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。


10、菌落PCR无条带?

答:主要有以下可能情况:

1)引物不正确:推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。

2)PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带。建议优化PCR体系、程序;或者提取质粒,以质粒做模板PCR验证;或者进行酶切验证。

3)重组失败:没有目的条带,只有空质粒的条带。说明重组不成功,载体线性化不完全,建议优化酶切体系。